Fue fundada en el año 1535 por D. Juan Téllez Girón, IV Conde de Ureña, al conseguir una bula papal para que la que ya era Parroquia fuera al mismo tiempo Colegiata. El templo se construyó en el lugar que ocupó la Iglesia del Castillo, totalmente destruida por un incendio. El exterior del templo sorprende por su severidad, La iglesia está construida con el sillar extraído de las canteras de Osuna. En la fachada principal cuatro contrafuertes cuadrangulares se alzan como elementos principales de su bella portada. En el lateral izquierdo, se levanta la torre, obra realizada a partir de 1914, y que aún se encuentra inacabada.
Se puede acceder al interior de la Colegiata a través del pequeño Patio del Panteón de los Duques de Osuna o Santo Sepulcro, que fue construido entre 1544 y 1555, y que es una de las muestras más bellas del Renacimiento español.
Conserva en el interior de sus cuatro salas obras de gran relevancia, como cuadros y ornamentos realizados por importantes artistas de los siglos XVI al XIX. Entre los cuadros destacan San Jerónimo y el Ángel del Juicio, Martirio de San Sebastián y Martirio de San Bartolomé, todos ellos realizados por José de Ribera «El Españoleto» en el siglo XVII.
María de la Cueva, esposa del IV conde de Ureña, Juan Téllez Girón, madre del I duque de Osuna, junto a su marido será la responsable de las fundaciones más destacadas de Osuna, la colegiata y el Panteón ducal, en que se puede ver representado su escudo, así como el Hospital de la Encarnación del Hijo de Dios, sobre cuyo solar, la IV duquesa de Osuna, Isabel de Sandoval, fundaría el Monasterio de la Encarnación para la orden mercedaria.
Nacida en el castillo de Cuéllar, fue hija de Francisco Fernández de la Cueva y Mendoza, II duque de Alburquerque, y de su segunda esposa, Francisca Álvarez de Toledo, hija del I duque de Alba, fue hermana de Beltrán, III duque de Alburquerque, de Luis, capitán de Carlos V, de Bartolomé, cardenal y virrey de Nápoles, y de Diego, mayordomo de Carlos V, entre otros.
¿CON QUÉ APODO SE LE CONOCE AL PINTOR JOSÉ DE RIBERA?
El Hispano
El niño de Osuna
El españoleto
¿DÓNDE NACIÓ MARÍA DE LA CUEVA?
En La Calle Real
En el Castillo de Cuéllar
En Roma
¿QUÉ OCURRIÓ CON LA IGLESIA DEL CASTILLO?
Se destruyó en un incendio
Se trasladó a otro lugar
Se hundió con un terremoto